МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ИНСТИТУТ ТОКСИКОЛОГИИ

193019, Санкт-Петербург, ул. Бехтерева 1
Телефон: 256-06-80
Телефакс; 567-55-66

УТВЕРЖДАЮ

Института токсикологии
Мин.здрава Российской Федерации,
Доктор мед. наук, профессор

А.Н. Петров

"12"12- 2000 г.

ОТЧЕТ

об экспериментальном исследовании аллергенного действия препарата «WN-криомелт»

Научный руководитель А.Б. Космачев
доктор медицинских наук

Санкт-Петербург, 2000 г.

Список исполнителей:

• Ведущий, научн., сотрудник, канд. мед. Наук С.Е. Колбасов (ответственный исполнитель)
• Ведущий научи, сотрудник, В.Л. Алексеев
• Ведущий научн, сотрудник В. К. Суханкин канд. мед. наук
• Научи, сотрудник М.В. Мелихова
• Старший научн. сотрудник В. В. Трефилов
• Ведущий научи. сотрудник, Г. С. Стройкова канд. мед, паук

Работу обеспечивали:

• Л.М. Пименова,
• Л.Н. Алпатова,
• С.Ю. Пилиляк
• Ветеринарный врач   Е.Г. Потапенко

3

РЕФЕРАТ

Отчет представлен на 16 стр., содержит 4 таблиц. Количество использованных источников — 5.

Целью работы являлось доклиническое изучение сенсибилизирующих свойств препарата «WN-криомелт». Опыты выполнены на мышах линии СВА, морских свинках и крысах обоего пола при внутримышечном введении (предполагаемое применение у человека) в дозах 0,5 и 5.0 мл/кг (терапевтическая доза и доза, в 10 раз большая).

Показано, что препарат «WN-криомелт» во всех исследованных дозах не вызывал сенсибилизации, выявляемой в коньюктивалъной пробе, непрямой реакции дегрануляции тучных клеток и реакции иммунных комплексов.
Показано, что при введении в течение 5 дней дозы «WN-криомелта» 5.0 мл/кг не развивается сенсибилизация, определяемая по реакции общей анафилаксии (анафилактический шок).

Ключевые слова:  препарат «WN-криомелт»; аллергенные свойства; мыши; морские свинки; гиперчувствительность замедленного типа; сенсибилизирующая активность.

4

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

• 1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
• 1.1. Животные и их содержание
• 1.2. Перечень регистрируемых показателей
• 1.3. Методические процедуры
• 1-3-1. Распределение животных по группам
• 1.3.2. Оценка аллергенных свойств
• 1.3.3. Статистическая обработка результатов
• 2. РЕЗУЛЬТАТЫ исследования
• 2-1.1- Реакция общей анафилаксии (анафилактический шок)
• 2.1.2. Реакция непрямой дегрануляции тучных клеток
• 2.1.3. Реакция иммунных комплексов
• 2.1.4. Конъюктивальная проба.
• ЗАКЛЮЧЕНИЕ
• СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ВВЕДЕНИЕ

Препарат «WN-криомелт» разработан 000 «МП Северная пчела» (Санкт-
Петербург) и предназначен дня лечения поражений печени (гепатитов, циррозов).
Представляет собой нативный раствор меда в воде, приготовленный по оригинальной запатентованной технологии.

Препарат вводится внутримышечно 1 раз в 3 дня по 1 мл в течение 1 месяца.

При исследовании острой токсичности было показано, что препарат «WN-криомелт» обладает чрезвычайно низкой токсичностью,

Исследование аллергенных свойств препарата «WN-криомелт» проводится в соответствии с «Методическими рекомендациями по оценке аллергизирующих свойств фармакологических веществ» и «Методическими указаниями по доклиническому изучению новых препаратов, разрабатываемых из природного сырья», МЗ РФ, 2000 г.

ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ

1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

1.1. Животные и их содержание

Эксперименты выполнялись на мышах линии СВА, белых беспородных крысах и морских свинках обоего пола. Морские свинки крысы и мыши поступили из питомника РАМН Рапполово, Санкт-Петербург.

КАРАНТИН

Длительность карантина (акклиматизационного периода) для всех животных составляла 14 (четырнадцать) дней. В течение карантина проводили ежедневный осмотр каждого животного (поведение и общее состояние), дважды в день животных наблюдали в клетках (заболеваемость и смертность). Перед началом исследования животные, отвечающие критериям включения в исследование, были распределены на группы с помощью метода рандомизации. Животные, не соответствующие критериям .включения в исследование, исключены из работы в течение карантина.

СОДЕРЖАНИЕ ЖИВОТНЫХ

Клетки с животными разных видов были помещены в отдельные комнаты. Световой режим: 12 часов — свет, 12 часов — темнота. Температура поддерживалась в пределах 18-20°С, относительная влажность — 50-70%. Температура и влажность регистрировались ежедневно. Проветривание и стерилизация воздуха с помощью кварцевой лампы осуществлялись также ежедневно,

НАБЛЮДЕНИЕ ЗА ЖИВОТНЫМИ

В течение исследования каждое животное было осмотрено ежедневно- Осмотр включал в себя оценку общего поведения и общего состояния животных. Пальпации подлежали зрительно выявляемые патологические образования. Результаты осмотра заносились в лабораторные  карты.

1.2. Перечень регистрируемых показателей

При исследовании аллергенных свойств препарата применяли регистрацию реакции общей анафилаксии, реакции, иммунных комплексов, коньюктивальной пробы и непрямой реакции дегрануляции тучных клеток после внутримышечного введения препарата в дозах 0.5 и 5.0 мл/кг

1.3. Методические процедуры
1.3.1. Распределение животных по группам

Животные (морские свинки и мыши линии СВА) были распределены по группам следующим образом:

группа 1 — самки, контроль (К), дистиллированная вода;

группа 2 — самки, «WN-криомелт», 0.5 мл/кг;

группа 3 — самки, «WN-криомелт», 5.0 мл/кг;

группа 4 — самцы, контроль (К), дистиллированная вода;

группа 5 — самцы, «WN-криомелт», 0.5 мл/кг;

группа 6 — самцы, «WN-криомелт», 5.0 мл/кг;

В каждой группе было представлено 6-8 животных.

1.3.2. Оценка аллергенных свойств

РЕАКЦИЯ ОБЩВЙ АНАФИЛАКСИИ (АНАФИЛАКТИЧЕСКИЙ ШОК)

Морским свинкам вводили внутримышечно в соответствии с инструкцией по
Применению «WN-криомелт» в дозах 0.5 и 5.0 мл/кг в течение 5 дней,

Через 21 день после окончания сенсибилизации животным внутрисердечно вводили разрешающую дозу, равную суммарной сенсибипизирующей Такую же дозу вводили морским свинкам контрольных групп.

Учет интенсивности анафилактического шока проводился в индексах по Weigle:

++++   — шок со смертельным исходом;

+++   — шок тяжелой степени (общие судороги, асфиксия, животное теряет способность удерживаться на лапах, падает на бок, не погибает);

++    — шок умеренный (небольшие судороги, выраженные явления бронхоспазма);

+— шок слабый ( некоторое беспокойство, учащенное дыхание, поче-
сывание мордочки, непроизвольное мочеиспускание, дефекация,
шерсть взъерошена);

О— шок не развился, признаки его отсутствуют.

РЕАКЦИЯ ИММУННЫХ КОМПЛЕКСОВ

Для постановки реакции использовали морских свинок, которым вводили препарат «WN-криомелт» в дозе 0.5 и 5.0 мл/кг. В контрольных группах использовали дистиллированную воду в таком же объеме.

Через 10 суток после последнего введения препарата осуществляли введение разрешающей дозы внутрикожно в объеме 0.5 мл.

Разрешающую дозу препарата определяли на интактных животных. За разрешающую дозу принимали наибольшее разведение антигена, не вызывающее видимых изменений в коже через 3 час после введения. В наших экспериментах такой дозой явилась концентрация препарата 0.25 мл.

В контрольных группах таким же способом вводили растворитель.

Учет реакции проводили визуально (в баллах по С.В. Суворову). В положительном случае уже через 30 минут на месте инъекции может развиться отек и гиперемия. Через 2-3 часа воспалительный очаг может уплотнится и кожа становится буро-красной. При гистологическом исследовании в случае лоложительной реакции может быть обнаружено острое геморрагическое воспаление, в инфильтрированном участке могут быть видны полиморфно-ядерные лейкоциты.

НЕПРЯМАЯ РЕАКЦИЯ ДЕГРАНУЛЯЦИИ ТУЧНЫХ КЛЕТОК.

Для получения тучных клеток использовали беспороднькх крыс. Для этого обескровленным крысам в брюшную полость вводили б мл стерильного физиологического раствора (рН = 7.4), подогретого до температуры 37°С. После массажа в течение 1 мин брюшной стенки, по средней пинии брюшины делали разрез длиной 1.5 см. Переворачивали тушку разрезом вниз и собирали экссудат, стекающий по петлям кишечника в стерильную пробирку.

Препараты готовили на предметных стеклах окрашенных заранее 0,3% спиртовым раствором нейтрального красного и высушенных при комнатной температуре.

К 30 мкл взвеси тучных клеток добавляли 30 мкл сыворотки опытного животного и 30 мкл исследуемого препарата в заранее подобранной дозе таким образом, чтобы дегрануляция тучных клеток в контроле не превышала 5%. В случае «WN-криомелт» использовалась исходная лекарственная форма.

Затем препараты покрывают покровным стеклом, края которого смазаны вазелином, и инкубируют в термостате при 37°С в течение 15 мин.

После этого препарат микроскопируют под увеличением х20. Оценку результатов проводят дифференциальным способом учета, подсчитывая показатель дегрануляции тучных клеток (ПДТК) по формуле:

ПДТК = (1а + 2б + 3с + 3д) / 100,

где а, б, с, д — количество (среднее из трех повторений) дегранулированных клеток соответственно степени дегрануляцнн (слабо выраженной, умеренной, резкой и полной дегрануляции клеток). В каждом препарате подсчитывали 100 клеток.
Реакцию считали положительной, если ПДТК превышал 0.2.

КОНЬЮКТИВАЛЬНАЯ ПРОБА

Для постановки пробы I каплю (50 мкл) препарата вводили под верхнее веко морских свинок контрольных и опытных групп. Под верхнее веко второго глаза вводили такой же объем дистиллированной воды (контроль) -

Реакцию учитывали через 15 мин и через 24-^8 часов в баллах в соответствии с Методическими рекомендациями Фармкомитета по оценке аллергенных свойств фармакологических средств (стр. 11).

1.3.3. Статистическая обработка результатов

Результаты экспериментов обрабатывались методами вариационной статистики с использованием  t-критерия Стьюдента.

2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1.1. Реакция общей анафилаксии (анафилактический шок)

В соответствии с Методическими рекомендациями при изучении сенсибилизирующих свойств препарата «WN-криомелт» была оценена возможность развития анафилактического шока после внутримышечного введения морским свинкам обоего пола в дозах 0.5 и 5.0 мл/кг в течение 5 дней. В контроле (К) животные получали равный объем дистиллированной воды.

Через 21 день после окончания введения препарата внутрисердечно всем опытным и контрольным группам была введена разрешающая доза «WN-криомелт».
Оценку реакции проводили в индексах по Weiglе (см. раздел «Методические процедуры»). Полученные результаты представлены в таблице 2.1.1.1.

Таблица 2,1.1,1

Оценка реакции общей анафилаксии (индексы по Weiglе ) у морских свинок
после применения препарата «WN-криомелт»

Таким образом, признаки даже умеренного шока не были выявлены ни у одного животного из группы самок и из группы самцов, получавших «WN криомелт» в исследованных дозах.

2.1.2. Реакция непрямой дегрануляции тучных клеток

Постановка реакции изложена в разделе «Методические процедуры». Эксперименты выполнены на морских свинках, у которых на 10 день после внутримышечного введения «WN-криомелта» в дозах 0.5 и 5.0 мл/кг была взята кровь для получения сыворотки. Полученные показатели дегрануляции тучных клеток крыс. в присутствии опытных и контрольных сывороток, препарата «WN-криомелт» или физиологического раствора в контроле представлены а таблице 2.1.2.1.

Таблица 2.1.2.1

Реакция дегрануляции тучных клеток крыс в присутствии сывороток морских
свинок получавших «WN-криомелт» в терапевтических и в 10 раз больших
дозах в течение месяца

Среди полученных показателей дегрануляции тучных клеток ни в одном из случаев не превышали значение 0.2, после которого эта реакция считается положительной  (Методические рекомендации по оценке аллергизирующих свойств фармакологических веществ). Во всех остальных случаях он был ниже этого значения и, следовательно, отрицательным. Полученные данные, обработанные статистически^ представлены в таблице 2.1.2.2.

Таблица 2.1.2-2

Сравнение показателей дегрануляции тучных клеток в опытных и контрольных
группах морских свинок

Таким образом, достоверных отличий в средних значениях ПДТК в опытных и .контрольных группах самок и самцов морских свинок, получавших препарат «WN-криомелт» в дозах 0.5 и 5.0 мл/кг в течение месяца, не выявлено. Эти данные позволяют заключить, что при внутримышечном введении препарат «WN -криомелт» не обладает алергенными свойствами, выявляемыми в непрямой реакции  деграиуляции тучных клеток.

2.1.3. Реакция иммунных комплексов

Постановка реакции изложена в разделе «Методические процедуры». Сенсибилизацию морских свинок осуществляли путем внутримышечного введения препарата «WN -криомелт» в дозах 0.5 и 5.0 мл/кг в течение 5 дней. Через 10 суток после последнего введения внутрикожно вводили разрешающую дозу препарата. Эту дозу определяли на интактных животных и наибольшим разведением препарата, не вызывающим видимых изменений в коже через час после внутрикожной инъекции. В контроле вводили такое же разведения растворителя — физиологического раствора. Подученные результаты представлены в таблицах 2.1.3.1-2.3.1,6.

Учет реакции проводили визуально начиная с 30 мин после введения разрешающей дозы. На этом сроке никаких проявлений на коже обнаружено не ыло. Никаких признаков реакции не было обнаружено спустя 1, 4 и 24 часа после се постановки.

Таблица 2.1.3.1

Реакция иммунных комплексов у опытных и контрольных групп морских свинок
через 1 час после введения разрешающей дозы

Через 1 час

Через 4 час

Через 24 час

Примечание: в числителе -- результат реакции в опыте, в знаменателе — резульат в контроле.

Учитьгаяя отсутствие показателей реакции в опыте и контроле на всех сроках на блюдения, можно придти к выводу, что при внутримышечном применении препарат «WN-криомелт» не обладает аллергенными свойствами, выявляемыми в реакции иммунных комплексов.

2.1.4. Конъюктивальная проба

Конъюктивальную пробу проводили на 10 день после окончания внутримышечного введения «WN-криомелта» в дозах 0.5 и 5.0 мл/кг (опытные группы) или равного объема дистиллированной воды в течение 5 дней.

Ни у одного животного опытных и контрольных групп не было реакции на введение препарата,  как  и в контроле с дистиллированной водой.

Полученные данные свидетельствуют об отсутствии у «WN-криомелт» аллергенных свойств, выявляемых в конъюктивальной пробе.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате изучения аллергенного действия препарата «WN-криомелт» на морских свинках обоего пола было показано, что он не вызывает реакции общей анафилаксии при применении даже в дозах, в 10 раз больше терапевтической. Кроме того, конъюктивалъные пробы, реакции дегрануляции тучных клеток и реакции иммунных комплексов были отрицательными.

Эти данные позволяют заключить, что препарат «WN-криомелт» не обладает аллергенными свойствами.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ:

1. Любимов Б.И., Коваленко Л.П., Федосеева ВМ. и др. Методические рекомендации по оценке аллергизирующих свойств фармакологических веществ. В сб. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. М. .Минздрав РФ, 2000, с. 25-32.
2. Кукес В.Г.. Булоев В.М., Колхир В. К. и др. Методическне указания по доклиническому изучению новых препаратов, разрабатываемых из природного сырья. В сб. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармаяологических веществ. М.,-Минздрав РФ, 2000 с. 346-348.
3. Федосеева В.Н., Порядин Г.В., Ковальчук Л.В„ Чередеев А.Н., Коган В.Ю. Руководство по иммунологическим н аллергологическим методам в гигиенических исследованиях, ПРОМЕДЭК, Москва, 1993.
4. Фрадкин В.А. Адлергодиагностика  in vitrо, Москва, «Медицина», 1975