АКЦИЯ! 2 упаковки по цене одной! ВАЖНО! Криомелт МН показан для профилактики и лечения вирусных заболеваний. Особенно Криомелт МН эффективен при первых признаках заражения, что крайне актуально, учитывая сложившуюся эпидемиологическую ситуацию с коронавирусом. Позаботьтесь о себе и близких!

Отчет по исследованию антимутагенной активности медицинского препарата КРИОМЕЛТ МН.

Введение. В настоящее время проблема поиска и создания препаратов, обладающих антимутагенным действием, приобретает особую остроту.
Это связано с тем, что в больших масштабах происходит загрязнение окружающей среды химическими веществами антропогенного происхождения, при этом некоторые из них обладают в разной степени мутагенным и канцерогенным действием. Кроме того, в медицине используются противораковые лекарственные препараты и физические воздействия, побочным эффектом которых может быть индукция мутаций в половых и соматических клетках пациентов. В связи с возникновением "озоновых дыр" остро встала проблема борьбы с мутагенным действием УФ-лучей солнечного происхождения, которые являются сильнейшим из известных физических мутагенов. Известно, что причиной раковых заболеваний, как правило, являются нарушения генетического материала перерожденной клетки, то есть мутационные изменения, поэтому антимутагенные препараты могут иметь и антиканцерогенное действие. Можно представить два наиболее вероятных механизма антимутагенного действия химических препаратов. Во-первых, это могут быть вещества, перехватывающие и инактивирующие мутагены в клетке или  организме. Такие антимутагенные препараты могут использоваться в тех случаях, когда заранее известно, что мутаген попадет в организм. Во-вторых, антимутагенами могут быть химические вещества, способные стимулировать клеточные системы, которые в норме нацелены на борьбу с мутагенными повреждениями генетического материала клетки. Этот класс антимутагенов является наиболее перспективным для медицинского применения, так как он не так жестко ограничен сроками применения, как в предыдущем случае, и, что особенно важно, такие вещества могут защищать клетку от мутагенов, обладающих совершенно различной специфичностью индуцированных повреждений генетического материала. К тому же у таких веществ трудно ожидать побочных неблагоприятных воздействий на организм.
Проблема разработки антимутагенных препаратов сильно затруднена отсутствием быстрых и надежных методов оценки мутагенной и особенно антимутагенной активности исследуемых препаратов. Возникновение мутаций - редкое событие, поэтому для надежного определения частоты индуцированных мутаций необходимо анализировать потомки сотен тысяч мутагенизированных клеток. В связи с этим необходимо иметь тест-системы высокочувствительные к мутагенному действию различных веществ. При этом такие тест системы должны давать достаточно быстрый и точный ответ, а также быть относительно дешевы. Идеальная тест-система для выявления мутагенов и канцерогенов должна учитывать любые типы повреждений генетического материала, чтобы максимально уменьшить число ошибочных негативных результатов. Генетическим событием наиболее подходящим для этих целей является индукция прямых генных мутаций. Такая система создана в ПИЯФ РАН и включает штаммы, несущие уникальный набор мутаций, позволяющий с высокой чувствительностью и точностью определять степень генетической опасности исследуемых веществ.

Цель настоящей работы - охарактеризовать антимутагенные свойства КРИОМЕЛТА (КР) после воздействия различных агентов повреждающих генетический материал клетки.


Материалы и методы - Анализ проводился на базе тест-системы С3, разработанной в ПИЯФ и разрешенной к использованию для данных целей Госкомприроды СССР. Учитывалась индукция прямых генных мутаций по пяти генам, контролирующим биосинтез аденина.
Тестерная линия дрожжей Saccharomyces cerevisiae 2-LMG-3031, генотипа MATa ade2-248 leu2 rad2 hsm3. Ген МАТ контролирует пол клетки, мутантный ген ade2-248 блокирует биосинтез нуклеиновых кислот, мутантный ген leu2 блокирует синтез аминокислоты лейцина, мутантный ген rad2 приводит к высокой чувствительности клетки к ультрафиолетовым лучам и ряду химических мутагенов, мутантный ген hsm3 резко повышает уровень индуцированных мутаций. Генотип созданной тестерной линии позволяет учитывать возникновение прямых мутаций в 5 генах, контролирующих биосинтез аденина, предшественника биосинтеза нуклеиновых кислот. Разрушенный ген ade2 придает колониям дрожжевых клеток красную окраску, а мутация в одном из 5 вышеупомянутых генов изменяет окраску колоний на белую. По появлению белых колоний мутантов судят об интенсивности мутагенеза. Мутации rad2 и hsm3 в сотни раз повышают чувствительность клеток дрожжей к мутагенному и летальному действию различных химических и физических мутагенов. Перечисленные выше свойства тестерной линии позволяют с наименьшими затратами учитывать такое редкое событие как возникновение мутации в определенном гене.


Питательная среда - для выращивания тестерных культур. Основная среда, использованная в данной работе, имела следующий состав: глюкоза - 2 г/л, этиловый спирт - 20 мл/л, КН2РО - 2 г/л, МgSО - 1 г/л, (NН4)2SО4 - 1 г/л, дрожжевой автолизат - 2 г/л, пептон - 2 г/л, агар-агар 30 г/л.


Метод культивирования - Перед началом экспериментов культура клеток расконсервировалась путем высева на жидкую питательную среду и выращивалась в течение 3 суток в термостате при 300 С.  После этого, суспензия выросших клеток разводилась водой и высевалась на чашки Петри с плотной (агаризированной) средой для получения отдельных клонов. После 3 суток выращивания отдельные красные клоны отбирались для выявления частоты спонтанных мутаций. Для определения частоты спонтанных мутаций  и устойчивости к канаванину методом упорядоченного посева использовали среду минимального состава с добавлением аминокислот и азотистых оснований, необходимых для роста тестируемых штаммов, и концентрации канаванина 60 мг/л.

Метод упорядоченного посева - определяет частоту спонтанных мутаций, появляющихся в процессе медленного роста клеток на селективной среде, содержащей определенную концентрацию канаванина, позволяющие клеткам поделиться 8-10 раз. Клетки инкубировали в 2 мл полной жидкой среды в течение двух дней, затем 1мл выросшей культуры разводили в 4 мл воды. Специальный репликатор со 150 штырями погружали в эту суспензию и переносили капли на чашки с селективной средой, содержащей канаванин и КР и на контрольные чашки без КР. Канаванин устойчивые мутанты росли быстрее немутантных клеток и выглядели как «бородавки» на фоне ограниченного роста тестируемых культур. После 15 дней инкубации число бородавок и общее число выросших на 150 пятнах клеток было подсчитано. Число выросших клеток определяли после их смыва с нескольких отдельных отпечатков, на которых не появлялись бородавки. Частоту мутаций на клетку на клеточное деление определяли при делении числа бородавок на число клеток на всех 150 отпечатках.

Облучение ультрафиолетовыми лучами - (УФ-лучи). Применяли лампу БУВ-30П с мощностью дозы на используемом уровне - 0,26 Дж/м2 сек. Суспензия дрожжевой культуры в дистиллированной воде с
концентрацией 107 клеток/мл в количестве 4 мл наливалась в стерильные чашки Петри и облучалась УФ-лучами в требуемой дозе. Немедленно после облучения исходную суспензию клеток разводили с таким расчетом, чтобы на чашках вырастало  для  учета выживаемости не более 500 клонов, а для учета мутагенеза 1000-1500 колоний. Рассев производили на среду, состав которой описан выше. Учет мутантов производили на 6-7 сутки инкубации под бинокуляром (увеличение в 15 раз).

Испытание препарата КР на антимутагенную активность - Для  оценки генетического эффекта препарата использовали одну  ампулу, содержимое которой разводили в 10 раз. Это позволило  заметно   снизить   вариабильность   результатов параллельных опытов и получить более точную характеристику действия препарата. Суспензию тестерных клеток, приготовленной на основе этого разбавленного препарата, вносили на чашки Петри по 0,1 мл. В результате конечная концентрация препарата в питательной среде составила 0,03%.


Результаты - При изучении генотоксичности нового фармакологического препарата КР мы обнаружили, что он не только не увеличивал выход прямых генных мутаций, но заметно снижал их уровень. Обработка КР клеток штамма 2-LMG-3031 в течение 24 часов привела к снижению частоты спонтанных мутаций в генах ADE4- ADE8 от (5.4 ± 1.2) x10-6 в контроле до (0.4 ± 0.1) х10-6. За это время КР не оказывал влияния на размножение клеток.

Три хорошо изученных мутагена УФ - и гамма–лучи и химический супермутаген этил-метан сульфонат (ЭМС), вызывающие различные первичные повреждения ДНК, были использованы, чтобы выяснить распространяется ли антимутагенное действие КР на летальные и мутагенные повреждения, индуцированные этими агентами. Данные Рис. 1 показывают, что КР понижал частоту мутаций в ADE4- ADE8 локусах у тестерного штамма при УФ-облучении примерно в два раза. В еще большей степени (примерно, в три раза) КР понижал частоту гамма индуцированных мутаций (рис. 2),  и в меньшей степени (полтора раза) - ЭМС индуцированных мутаций (рис.3). Ни в одном из проведенных экспериментов мы не обнаружили влияния КР на выживаемость клеток.

Приведенные выше результаты показывают, что действие КР, вероятно, связано не с первоначальными повреждениями ДНК, а с процессингом этих повреждений в мутации в течение работы систем репарации.

 


Рис. 1. Влияние КР на частоту мутаций, индуцированных УФ-лучами в локусах ADE4-ADE8 штамма 2-LMG-3031 (rad2 hsm3).


Рис. 2. Влияние КР на частоту мутаций, индуцированных γ-лучами в локусах ADE4-ADE8 штамма 2-LMG-3031 (rad2 hsm3).


Рис. 3. Влияние КР на частоту мутаций, индуцированных ЭМС в локусах ADE4-ADE8 штамма 2-LMG-3031 (rad2 hsm3).

Выводы:
1) КР не оказывает значимого влияния на выживаемость обрабатываемых клеток дрожжей.
2) КР способен в значительной степени понижать спонтанный мутагенез.
3) КР значительно понижает частоту мутаций, индуцированных различными ДНК-троными агентами (УФ - и гамма-лучи, этилметансульфонат), т.е. он может использоваться для защиты клеток от мутагенов, обладающих совершенно различной специфичностью индуцированных повреждений генетического материала.
4) Действие КР, вероятно, связано не с первоначальными повреждениями ДНК, а с процессингом этих повреждений в мутации в течение работы систем репарации.
5) Использование КР в качестве антимутагенного препарата возможно в период после воздействия мутагена, что особенно важно в аварийных ситуациях.

Рук. ОМРБ ПИЯФ РАН Дбн Королев В.Г.