Отчет Исследование влияния КРИОМЕЛТА на пролиферативную  и функциональную активность лимфоидных клеток  крови здоровых доноров.

Введение. В проведенном нами ранее исследовании было показано, что  Криомелт способен улучшать  клеточную жизнеспособность в культуре мононуклеарных клеток крови человека, возможно за счет мембраностабилизирующего эффекта и сдерживания процессов, приводящих к клеточному некрозу.
Цель настоящей работы - охарактеризовать иммуномодулирующие свойства Криомелт в ранее выбранном  диапазоне концентраций.
Материалы и методы. В исследовании были использованы мононуклеарные клетки (МНК) крови 10 здоровых доноров (5 мужчин и 5 женщин в  возрасте 25-42 г),   выделенные из крови градиентным центрифугированием. Клетки в концентрации 2 x 106/мл культивировали в течение 36 ч в присутствии неспецифического митогена- ФГА (фитогеммаглютинин Р,  PHA P, Sigma) и различных концентраций криомелта  (0.5х10-7 г/л, 1.0 х 10-7г/л, или 2.0 х 10-7г/л). В контрольных пробах клетки культивировали либо в среде (без ФГА и КР), либо присутствии только ФГА или КР.  По окончании культивирования определяли следующие параметры:

1. Поверхностные маркеры клеток методом проточной цитофлюориметрии:  CD4+, CD8+, CD4+CD45RO+, CD8+CD45RO+, CD4-CD45RO+, CD8-CD45RO+.
2. Пролиферативный ответ клеток  по включению в ДНК  радиоактивной метки (H3 –тимидин).
3. Цитокины в культуральных супернатантах:  фактор некроза опухоли – альфа (ФНО-альфа), интерлейкин-6 (ИЛ-6) и интерферон- альфа   (ИФН-альфа). Цитокины определяли с использованием иммуноферментных тест-систем производства компании  «Вектор-Бест» (Новосибирск).

Статистическую обработку результатов проводили с использованием парного критерия Стьюдента.
Результаты. Известно, что соотношение разных субпопуляций Т-лимфоцитов, вовлеченных в иммунный ответ, определяет силу и направленность иммунных реакций. Согласно данным представленным в таблице 1,   КР не оказывал значимого влияния на содержание CD4+ Т-клеток в митогенактивированной  лимфоидной популяции. 
Таблица 1. Процентное содержание  CD4+ Т-лимфоцитов.

№ донора	Контроль-среда	ФГА	ФГА+КР (0.5х10-7 г/л)	ФГА+КР (1.0х10-7 г/л)	ФГА+КР (2.0х10-7 г/л)	КР (2.0 х 10-7 г/л)
1	40,8	27,4	27,4	30,6	28,1	31,2
2	29,7	30,4	30,4	30,1	31,4	32,6
3	46,2	40,8	40,8	43,5	42,2	39,9
4	32,4	31,9	31,9	30,7	35,6	34,7
5	37,6	36,5	36,5	37,6	32,8	33,8
6	25,2	23,6	23,6	21,7	22,1	23,1
7	38,9	43,5	43,5	42,1	39,9	39,2
8	40,6	36	36	24,5	39,8	41,2
9	49,1	51	51	50,5	46,7	52,3
10	19,9	29,4	29,4	29,4	27,9	28,8
M + M	36,04	35,05	34,07		35,75

          Криомелт также не оказывал существенного влияния на содержание в митоген-активированной клеточной популяции хелперных CD4+CD45RO+ Т-лимфоцитов, ответственных за долговременную иммунную память (таблица 2)
Таблица 2. Процентное содержание  CD4+СD45RO+ Т-лимфоцитов.

Примечание: н.т.- не тестировано.
Данные процентного содержания СD4+ Т-хелперных лимфоцитов в митоген-активированных клетках суммированы на рисунке 1

 

Рисунок 1. Процентное содержание CD4+/RO+ и CD4+/RO- Т-лимфоцитов.
Таким образом, на основе полученных данных можно предположить, что действие Криомелт на иммунитет не связано с увеличением процентного содержания  в популяции лимфоцитов хелперных CD4+ Т-лимфоцитов. 
Твердо установлено, что развитие противовирусных эффекторных  иммунных реакций  ассоциируется с генерацией СD8+ Т-лимфоцитов  Данные, характеризующие влияние Криомелт на содержание CD8+ и СD8+RO+ Т-лимфоцитов, представлены в таблицах 3 и 4.  
Таблица 3. Процентное содержание  CD8+ Т-лимфоцитов. 

№	Контроль-среда	ФГА	ФГА+КР (0.5х10-7 г/л)	ФГА+КР (1.0х10-7 г/л)	ФГА+КР (2.0х10-7 г/л)	КР (2.0 х 10-7 г/л)
1	2,7	10	8,4	14	9,3	19,4
2	3,8	19,9	15,9	16,6	20,7	29,9
3	4,5	14,8	15,8	15,8	13,7	22,1
4	6,8	15,6	16,3	14,1	13,4	26,3
5	11,7	20,5	13,9	15,3	15,1	20,9
6	31,7	40	41,2	40,9	42,5	46,1
7	2,8	11,5	8,6	6,2	7,2	19,2
8	3,4	9,6	10,8	17	15,1	18
9	3,9	12,6	11,2	12,6	12,4	н.т.
10	2,8	6,6	5,9	4,9	6,5	н.т.
M + m

 

Таблица 4. Процентное содержание  CD8+CD45RO+ Т- лимфоцитов. 

№ доно ра	Контроль-среда	ФГА	ФГА+КР (0.5х10-7 г/л)	ФГА+КР (1.0х10-7 г/л)	ФГА+КР (2.0х10-7 г/л)	КР (2.0 х 10-7 г/л)
1	0,5	1,7	1,2	2,5	1,7	4,1
2	0,3	3,2	2,6	2,6	3,8	6,7
3	0,8	4,6	4,8	4,7	3,9	6,8
4	0,9	2,3	1,9	1,6	1,6	3,9
5	1	2,2	1,2	1,2	1,2	1,9
6	1	2,1	1,9	2	2,4	3,2
7	0,4	1,8	1,3	1	1,1	3,8
8	0,2	0,5	0,7	1,7	1,3	1,7
9	0,9	3,4	2,9	4	3,9	н.т.
10	1,1	0,9	1	0,7	1,1	н.т.
M + m

 

Данные таблиц 3 и 4 суммированы на рисунке 2.

Рисунок 2. Процентное содержание CD8+/RO+ и CD8+/RO- Т-лимфоцитов.
Таким образом,  согласно полученным данным, Криомелт не оказывал существенного влияния на процентное содержание CD8+/RO+ и CD8+/RO- Т-лимфоцитов в митоген-активированной клеточной популяции. С другой стороны, выявлено  самостоятельное влияние Криомелт (в отсутствие митогена)  на содержание  цитотоксических Т-лимфоцитов в лимфоидной популяции. Как следует из представленных данных, в присутствии Криомелт имело место более чем двукратное достоверное увеличение содержания  СD8+ Т-клеток  и четырехкратное увеличение  CD8+CD45RO+ Т-клеток (P < 0.05).
Цитофлюорограммы, характеризующие влияние Криомелт на субпопуляционный состав CD8+ Т-лимфоцитов, приведены ниже.

 

 

№ 1.
 
№2
№3
№4

№5
№6

 

№7
№8

 

№9

№10

Как известно, воспалительная реакция является неотьемлемой частью иммуногенеза. Избыточность или недостаточность воспаления играют значимую роль в патогенезе многих заболеваний, в том числе и тех, которые обусловлены вирусной инфекцией. ФНО-альфа и ИЛ-6 –цитокины, в значительной степени определяющие степень воспаления. Данные, характеризующие влияние Криомелт на продукцию этих цитокинов представлены в  таблицах 5 и 6  и рисунках  3 и 4.
Таблица 5.  Содержание  ФНО-альфа (пг/мл) в культуральных супернатантах.

№	ФГА	ФГA+КР (0.5х10-7 г/л)	ФГA+КР (1.0х10-7 г/л)	ФГA+КР (2.0х10-7 г/л)	КР (2.0х10-7 г/л)
1	16	14,5	12	16,5	11,5
2	92	77	96,5	91	12,5
3	19	12,5	15	13	19,5
4	156	121	23,5	26	60,5
5	53,5	40,5	52	76	47,5
6	8	6	0	6,5	5,5
7	50	17	17	19	33
8	38	16	18	16	25
9	9	32	12	17	н.т
10	16	12	14	10	н.т
M + m	45,75	34,85	26,17	29,1	26,8

Рисунок 3. Концентрация ФНО-альфа (пг/мл)   в культуральных супернатантах.
Согласно полученным данным КР, обладал достоверной способностью (P < 0.05) супрессировать продукцию ФНО-альфа, осуществляемую  митоген-активированными мононуклеарными клетками. 
Таблица 6.  Содержание  ИЛ-6 (пг/мл) в культуральных супернатантах.

№	ФГА	ФГA+КР (0.5х10-7 г/л)	ФГA+КР (1.0х10-7 г/л)	ФГA+КР (2.0х10-7 г/л)	КР (2.0х10-7 г/л)
1	637	730	688	770,5	273,5
2	810	827,5	810	874	459
3	804	806	812	774	784
4	766,5	887	821,5	805,5	769
5	847,5	857,5	870	793,5	913,5
6	152	187	102,5	167	76,5
7	753	649	718	493	414
8	899	836	816	847	783
9	746	643	810	636	н.т
10	211	367	317	240	н.т
M + m	662,6	679	676,5	640	559,0

Рисунок 4. Концентрация  ИЛ-6 (пг/мл) в культуральных  супернатантах.
Из представленных данных следует, что Криомелт не оказывал статистически значимого  влияния на продукцию ИЛ-6, осуществляемую митоген-активированными мононуклеарными клетками человека.  
Как известно, ИФ-альфа играет ключевую роль в противовирусной защите организме. Данные, характеризующие продукцию этого цитокина митоген-активированными мононуклеарными клетками в присутствии КР, представлены в таблице 7 .

 

 

Таблица 7.  Содержание ИФ-альфа (пг/мл) в культуральных супернатантах.

№	ФГА	ФГA+КР (0.5х10-7 г/л)	ФГA+КР (1.0х10-7 г/л)	ФГA+КР (2.0х10-7 г/л)	КР (2.0х10-7 г/л)
1	14,5	0	0	0	0
2	0	0	0	28,5	7,5
3	0	0	0	0	1,5
4	10,5	23	0	0	0
5	0	0	0	0	17,5
6	0	0	0	0	0
7	0	0	0	0	40
8	11	21	0	8	0
9	0	4	14,9	28	н.т.
10	0	0	22	0	н.т.

Как следует из представленных данных, Криомелт оказывал разнонаправленное влияние на продукцию ИФ-альфа мононуклеарными  клетками, полученными от разных доноров. 
Пролиферативный ответ лимфоидных клеток может являться суммарным показателем эффективности  иммунотропного  воздействия вещества.  Данные,  характеризующие влияние Криомелт на лимфоидную пролиферацию представлены в таблице 8 и рисунке 5.

Таблица 8. Влияние Криомелт на лимфоидную пролиферацию.

№	контроль	ФГА	ФГA+КР (0.5х10-7 г/л)	ФГA+КР (1.0х10-7 г/л)	ФГA+КР (2.0х10-7 г/л)	КР (2.0х10-7 г/л)
1	163	3007	4345	2546	2520	3733
2	214	3640	3902	1467	3776	2919
3	263	5011	3473	2850	3454	3477
4	224	5374	3626	4923	11664	5632
5	246	1803	3211	2960	2158	5365
M + m	222 + 33	3767 +1283	3711+380	2949+1097	4714+3454	4225+1054

Рисунок 5. Влияние Криомелт на лимфоидную пролиферацию
Согласно  полученным данным  КР сам по себе,   обладает выраженной способностью стимулировать лимфоидную пролиферацию, сопоставимую с таковой ФГА. Интересно, что эффекты ФГА и Криомелт на пролиферацию не суммировались.

Заключение. Полученные данные предполагают, что Криомелт является активатором лимфоцитов. Иммунотропную противовирусную активность  Криомелт можно объяснить его самостоятельной способностью  избирательно  увеличивать в  популяции лимфоцитов  содержание CD8+RO- и СD8+RO+ Т-клеток.  Мы не получили данных, которые указывали бы, что Криомелт является индуктором ИФ-альфа. Тем не менее, взаимоотношение  Криомелт с синтезом и действием  интерферонов I типа требует дальнейших исследований. Согласно полученным данным,  Криомелт способен  супрессировать выработку ФНО-альфа, осуществляемую  активированными иммунокомпетентными клетками. Ингибиция выработки ФНО-альфа может лежать в основе противоспалительного действия КР. С другой стороны, повышенные концентрации ФНО-альфа были выявлены в культурах мононуклеарных клеток, активируемых Криомелт самостоятельно  в отсутствии ФГА. В целом, полученные данные подразумевают возможность наличия у Криомелт нормализующего действия на воспалительные процессы. Однако, это предположение нуждается в дальнейших экспериментальных подверждениях.

Выводы:
1) Криомелт не оказывает значимого влияния на относительное содержание CD4+RO- и  CD4+RO+ Т-клеток в  митоген-активированной  популяции лимфоцитов.
2) Криомелт способен    самостоятельно увеличивать относительное содержание CD8+RO- и СD8+RO+ Т-клеток   в митоген-активированной  популяции лимфоцитов.
3) Криомелт способен ингибировать продукцию клетками ФНО-альфа.
4) Криомелт не оказывает существенного влияния на клеточную продукцию ИЛ-6.
5) Криомелт может не являться интерфероногеном.
7) По отношению к лимфоцитам Криомелт обладает выраженными митогенными свойствами.
6) Полученные данные предполагают наличие у Криомелт выраженных иммуномодулирующих свойств, которые отличают его от других иммунотропных препаратов, обладающих противовирусной активностью.