АКЦИЯ! 2 упаковки по цене одной! ВАЖНО! Криомелт МН показан для профилактики и лечения вирусных заболеваний. Особенно Криомелт МН эффективен при первых признаках заражения, что крайне актуально, учитывая сложившуюся эпидемиологическую ситуацию с коронавирусом. Позаботьтесь о себе и близких!

Отчет Исследование влияния КРИОМЕЛТА на пролиферативную  и функциональную активность лимфоидных клеток  крови здоровых доноров.

Введение. В проведенном нами ранее исследовании было показано, что  Криомелт способен улучшать  клеточную жизнеспособность в культуре мононуклеарных клеток крови человека, возможно за счет мембраностабилизирующего эффекта и сдерживания процессов, приводящих к клеточному некрозу.
Цель настоящей работы - охарактеризовать иммуномодулирующие свойства Криомелт в ранее выбранном  диапазоне концентраций.
Материалы и методы. В исследовании были использованы мононуклеарные клетки (МНК) крови 10 здоровых доноров (5 мужчин и 5 женщин в  возрасте 25-42 г),   выделенные из крови градиентным центрифугированием. Клетки в концентрации 2 x 106/мл культивировали в течение 36 ч в присутствии неспецифического митогена- ФГА (фитогеммаглютинин Р,  PHA P, Sigma) и различных концентраций криомелта  (0.5х10-7 г/л, 1.0 х 10-7г/л, или 2.0 х 10-7г/л). В контрольных пробах клетки культивировали либо в среде (без ФГА и КР), либо присутствии только ФГА или КР.  По окончании культивирования определяли следующие параметры:

  1. Поверхностные маркеры клеток методом проточной цитофлюориметрии:  CD4+, CD8+, CD4+CD45RO+, CD8+CD45RO+, CD4-CD45RO+, CD8-CD45RO+.
  2. Пролиферативный ответ клеток  по включению в ДНК  радиоактивной метки (H3 –тимидин).
  3. Цитокины в культуральных супернатантах:  фактор некроза опухоли – альфа (ФНО-альфа), интерлейкин-6 (ИЛ-6) и интерферон- альфа   (ИФН-альфа). Цитокины определяли с использованием иммуноферментных тест-систем производства компании  «Вектор-Бест» (Новосибирск).

Статистическую обработку результатов проводили с использованием парного критерия Стьюдента.
Результаты. Известно, что соотношение разных субпопуляций Т-лимфоцитов, вовлеченных в иммунный ответ, определяет силу и направленность иммунных реакций. Согласно данным представленным в таблице 1,   КР не оказывал значимого влияния на содержание CD4+ Т-клеток в митогенактивированной  лимфоидной популяции. 
Таблица 1. Процентное содержание  CD4+ Т-лимфоцитов.


№ донора

Контроль-среда

ФГА

ФГА+КР
(0.5х10-7 г/л)

ФГА+КР
(1.0х10-7 г/л)

ФГА+КР
(2.0х10-7 г/л)

КР (2.0 х 10-7 г/л)

1

40,8

27,4

27,4

30,6

28,1

31,2

2

29,7

30,4

30,4

30,1

31,4

32,6

3

46,2

40,8

40,8

43,5

42,2

39,9

4

32,4

31,9

31,9

30,7

35,6

34,7

5

37,6

36,5

36,5

37,6

32,8

33,8

6

25,2

23,6

23,6

21,7

22,1

23,1

7

38,9

43,5

43,5

42,1

39,9

39,2

8

40,6

36

36

24,5

39,8

41,2

9

49,1

51

51

50,5

46,7

52,3

10

19,9

29,4

29,4

29,4

27,9

28,8

M +
M

36,04

35,05

34,07

35,75

          Криомелт также не оказывал существенного влияния на содержание в митоген-активированной клеточной популяции хелперных CD4+CD45RO+ Т-лимфоцитов, ответственных за долговременную иммунную память (таблица 2)
Таблица 2. Процентное содержание  CD4+СD45RO+ Т-лимфоцитов.


Контроль-среда

ФГА

ФГА+КР
(0.5х10-7 г/л)

ФГА+КР
(1.0х10-7 г/л)

ФГА+КР
(2.0х10-7 г/л)

КР (2.0 х 10-7 г/л)

1

21,1

13,2

15,6

13,2

15,4

21,4

2

17,6

17,5

17,3

18,6

19,5

25,3

3

27,4

24

25,9

25

23,6

24,3

4

15,4

15,1

14,8

17

16,6

17,9

5

19,4

19,3

20,9

16,8

17,6

19,3

6

17

15,3

14

14,7

15,3

18,8

7

22,6

24

22,6

21,5

21,5

29,8

8

19,7

14,4

9,6

17,1

16,8

20,8

9

24,8

23,3

22,8

22,5

24

н.т.

10

10,2

14,9

14,9

14,6

14,5

н.т.

M +
m

Примечание: н.т.- не тестировано.
Данные процентного содержания СD4+ Т-хелперных лимфоцитов в митоген-активированных клетках суммированы на рисунке 1

 


Рисунок 1. Процентное содержание CD4+/RO+ и CD4+/RO- Т-лимфоцитов.
Таким образом, на основе полученных данных можно предположить, что действие Криомелт на иммунитет не связано с увеличением процентного содержания  в популяции лимфоцитов хелперных CD4+ Т-лимфоцитов. 
Твердо установлено, что развитие противовирусных эффекторных  иммунных реакций  ассоциируется с генерацией СD8+ Т-лимфоцитов  Данные, характеризующие влияние Криомелт на содержание CD8+ и СD8+RO+ Т-лимфоцитов, представлены в таблицах 3 и 4.  
Таблица 3. Процентное содержание  CD8+ Т-лимфоцитов. 


Контроль-среда

ФГА

ФГА+КР
(0.5х10-7 г/л)

ФГА+КР
(1.0х10-7 г/л)

ФГА+КР
(2.0х10-7 г/л)

КР (2.0 х 10-7 г/л)

1

2,7

10

8,4

14

9,3

19,4

2

3,8

19,9

15,9

16,6

20,7

29,9

3

4,5

14,8

15,8

15,8

13,7

22,1

4

6,8

15,6

16,3

14,1

13,4

26,3

5

11,7

20,5

13,9

15,3

15,1

20,9

6

31,7

40

41,2

40,9

42,5

46,1

7

2,8

11,5

8,6

6,2

7,2

19,2

8

3,4

9,6

10,8

17

15,1

18

9

3,9

12,6

11,2

12,6

12,4

н.т.

10

2,8

6,6

5,9

4,9

6,5

н.т.

M +
m

 

Таблица 4. Процентное содержание  CD8+CD45RO+ Т- лимфоцитов. 


№ доно
ра

Контроль-среда

ФГА

ФГА+КР
(0.5х10-7 г/л)

ФГА+КР
(1.0х10-7 г/л)

ФГА+КР
(2.0х10-7 г/л)

КР (2.0 х 10-7 г/л)

1

0,5

1,7

1,2

2,5

1,7

4,1

2

0,3

3,2

2,6

2,6

3,8

6,7

3

0,8

4,6

4,8

4,7

3,9

6,8

4

0,9

2,3

1,9

1,6

1,6

3,9

5

1

2,2

1,2

1,2

1,2

1,9

6

1

2,1

1,9

2

2,4

3,2

7

0,4

1,8

1,3

1

1,1

3,8

8

0,2

0,5

0,7

1,7

1,3

1,7

9

0,9

3,4

2,9

4

3,9

н.т.

10

1,1

0,9

1

0,7

1,1

н.т.

M +
m

 

Данные таблиц 3 и 4 суммированы на рисунке 2.

Рисунок 2. Процентное содержание CD8+/RO+ и CD8+/RO- Т-лимфоцитов.
Таким образом,  согласно полученным данным, Криомелт не оказывал существенного влияния на процентное содержание CD8+/RO+ и CD8+/RO- Т-лимфоцитов в митоген-активированной клеточной популяции. С другой стороны, выявлено  самостоятельное влияние Криомелт (в отсутствие митогена)  на содержание  цитотоксических Т-лимфоцитов в лимфоидной популяции. Как следует из представленных данных, в присутствии Криомелт имело место более чем двукратное достоверное увеличение содержания  СD8+ Т-клеток  и четырехкратное увеличение  CD8+CD45RO+ Т-клеток (P < 0.05).
Цитофлюорограммы, характеризующие влияние Криомелт на субпопуляционный состав CD8+ Т-лимфоцитов, приведены ниже.

 

 

№ 1.
 
№2
№3
№4


№5
№6

 

№7
№8

 

№9

№10

Как известно, воспалительная реакция является неотьемлемой частью иммуногенеза. Избыточность или недостаточность воспаления играют значимую роль в патогенезе многих заболеваний, в том числе и тех, которые обусловлены вирусной инфекцией. ФНО-альфа и ИЛ-6 –цитокины, в значительной степени определяющие степень воспаления. Данные, характеризующие влияние Криомелт на продукцию этих цитокинов представлены в  таблицах 5 и 6  и рисунках  3 и 4.
Таблица 5.  Содержание  ФНО-альфа (пг/мл) в культуральных супернатантах.


ФГА

ФГA+КР
(0.5х10-7 г/л)

ФГA+КР
(1.0х10-7 г/л)

ФГA+КР
(2.0х10-7 г/л)

КР
(2.0х10-7 г/л)

1

16

14,5

12

16,5

11,5

2

92

77

96,5

91

12,5

3

19

12,5

15

13

19,5

4

156

121

23,5

26

60,5

5

53,5

40,5

52

76

47,5

6

8

6

0

6,5

5,5

7

50

17

17

19

33

8

38

16

18

16

25

9

9

32

12

17

н.т

10

16

12

14

10

н.т

M +
m

45,75

34,85

26,17

29,1

 

26,8


Рисунок 3. Концентрация ФНО-альфа (пг/мл)   в культуральных супернатантах.
Согласно полученным данным КР, обладал достоверной способностью (P < 0.05) супрессировать продукцию ФНО-альфа, осуществляемую  митоген-активированными мононуклеарными клетками. 
Таблица 6.  Содержание  ИЛ-6 (пг/мл) в культуральных супернатантах.


ФГА

ФГA+КР
(0.5х10-7 г/л)

ФГA+КР
(1.0х10-7 г/л)

ФГA+КР
(2.0х10-7 г/л)

КР
(2.0х10-7 г/л)

1

637

730

688

770,5

273,5

2

810

827,5

810

874

459

3

804

806

812

774

784

4

766,5

887

821,5

805,5

769

5

847,5

857,5

870

793,5

913,5

6

152

187

102,5

167

76,5

7

753

649

718

493

414

8

899

836

816

847

783

9

746

643

810

636

н.т

10

211

367

317

240

н.т

M +
m

662,6

679

676,5

640

559,0


Рисунок 4. Концентрация  ИЛ-6 (пг/мл) в культуральных  супернатантах.
Из представленных данных следует, что Криомелт не оказывал статистически значимого  влияния на продукцию ИЛ-6, осуществляемую митоген-активированными мононуклеарными клетками человека.  
Как известно, ИФ-альфа играет ключевую роль в противовирусной защите организме. Данные, характеризующие продукцию этого цитокина митоген-активированными мононуклеарными клетками в присутствии КР, представлены в таблице 7 .

 

 

Таблица 7.  Содержание ИФ-альфа (пг/мл) в культуральных супернатантах.


ФГА

ФГA+КР
(0.5х10-7 г/л)

ФГA+КР
(1.0х10-7 г/л)

ФГA+КР
(2.0х10-7 г/л)

КР
(2.0х10-7 г/л)

1

14,5

0

0

0

0

2

0

0

0

28,5

7,5

3

0

0

0

0

1,5

4

10,5

23

0

0

0

5

0

0

0

0

17,5

6

0

0

0

0

0

7

0

0

0

0

40

8

11

21

0

8

0

9

0

4

14,9

28

н.т.

10

0

0

22

0

н.т.

Как следует из представленных данных, Криомелт оказывал разнонаправленное влияние на продукцию ИФ-альфа мононуклеарными  клетками, полученными от разных доноров. 
Пролиферативный ответ лимфоидных клеток может являться суммарным показателем эффективности  иммунотропного  воздействия вещества.  Данные,  характеризующие влияние Криомелт на лимфоидную пролиферацию представлены в таблице 8 и рисунке 5.

Таблица 8. Влияние Криомелт на лимфоидную пролиферацию.


контроль

ФГА

ФГA+КР
(0.5х10-7 г/л)

ФГA+КР
(1.0х10-7 г/л)

ФГA+КР
(2.0х10-7 г/л)

КР
(2.0х10-7 г/л)

1

163

3007

4345

2546

2520

3733

2

214

3640

3902

1467

3776

2919

3

263

5011

3473

2850

3454

3477

4

224

5374

3626

4923

11664

5632

5

246

1803

3211

2960

2158

5365

M +
m

222 + 33

3767 +1283

3711+380

2949+1097

4714+3454

4225+1054


Рисунок 5. Влияние Криомелт на лимфоидную пролиферацию
Согласно  полученным данным  КР сам по себе,   обладает выраженной способностью стимулировать лимфоидную пролиферацию, сопоставимую с таковой ФГА. Интересно, что эффекты ФГА и Криомелт на пролиферацию не суммировались.

Заключение. Полученные данные предполагают, что Криомелт является активатором лимфоцитов. Иммунотропную противовирусную активность  Криомелт можно объяснить его самостоятельной способностью  избирательно  увеличивать в  популяции лимфоцитов  содержание CD8+RO- и СD8+RO+ Т-клеток.  Мы не получили данных, которые указывали бы, что Криомелт является индуктором ИФ-альфа. Тем не менее, взаимоотношение  Криомелт с синтезом и действием  интерферонов I типа требует дальнейших исследований. Согласно полученным данным,  Криомелт способен  супрессировать выработку ФНО-альфа, осуществляемую  активированными иммунокомпетентными клетками. Ингибиция выработки ФНО-альфа может лежать в основе противоспалительного действия КР. С другой стороны, повышенные концентрации ФНО-альфа были выявлены в культурах мононуклеарных клеток, активируемых Криомелт самостоятельно  в отсутствии ФГА. В целом, полученные данные подразумевают возможность наличия у Криомелт нормализующего действия на воспалительные процессы. Однако, это предположение нуждается в дальнейших экспериментальных подверждениях.

Выводы:
1) Криомелт не оказывает значимого влияния на относительное содержание CD4+RO- и  CD4+RO+ Т-клеток в  митоген-активированной  популяции лимфоцитов.
2) Криомелт способен    самостоятельно увеличивать относительное содержание CD8+RO- и СD8+RO+ Т-клеток   в митоген-активированной  популяции лимфоцитов.
3) Криомелт способен ингибировать продукцию клетками ФНО-альфа.
4) Криомелт не оказывает существенного влияния на клеточную продукцию ИЛ-6.
5) Криомелт может не являться интерфероногеном.
7) По отношению к лимфоцитам Криомелт обладает выраженными митогенными свойствами.
6) Полученные данные предполагают наличие у Криомелт выраженных иммуномодулирующих свойств, которые отличают его от других иммунотропных препаратов, обладающих противовирусной активностью.