Северо-Западная протицочумная
станция МЗ РФ
«Утверждаю»
Начальник Северо-Западной
Противочумной станции
Чмырь И.А.
17 января 2001г.
ОТЧЕТ
Исследование противовирусной активности медицинского препарата WN Криомелт на модели вируса герпеса 1 типа.
Санкт-Петербург
2001 г.
СПИСОК ИСПОЛНИТЕЛЕЙ
Научный руководитель кандидат медицинских наук доцент кафедры инфекционных болезней МАПО Г.И.Кирпичникова.
Ведущий научный сотрудник (ответственный исполнитель)В.А.Алексеев.
Зав. вир. Лаборатории СЗ ПЧС (ответственный исполнитель) П.В.Колотвина.
Кандидат медицинских наук Врач-вирусолог СЗ ПЧС Л.А.Автущенко
Врач-вирусолог СЗ ПЧСИ.Яровая.
Лаборант вир лаборатории СЗ ПЧСФ.М.Селезнёва.
1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Препарат WNR- криомелт (WN) медицинского назначения использовали в соответствии с рекомендациями заказчика.
1. Тканевые культуры
В работе были использованы культуры клеток Vего Е -6 и Нер-2, полученные из банка музея тканевых культур Института цитологии Санкт-Петербурга. Тканевые культуры были размножены путем пересева их на матрасы — емкостью 1000-1500 мл. Образовавшийся монослой снят со стекла с помощью 0,02 % р-ра версена и, полученная суспензия клеток после подсчета внесена в пробирки по 200 000 клеток на одну пробирку. Для роста клеток использовали среду ДМЕМ с 10% эмбриональной телячьей сывороткой. Пробирки помещали в термостат при 37 "С. Через 48 часов были отобраны пробирки со сформировавшимся монослоем, который использовали в дальнейших исследованиях. Поддерживающая среда — ДМЕМ без сыворотки.
Всего было использовано 2000 пробирок монослойпых тканевых культур.
2. Вирус.
В опыт был взят вирус герпеса 1 типа- №12-98 Санкт-Петербург — авторский штамм.
Проведено восстановление вируса из музейного штамма (3 пассажа), накопление необходимого для проведения опыта количества инфекционного материала.
Инфекционные титры вируса определяли путем титрования его с интервалом 0,5log. Каждое разведение вируса разливали в 4-10 пробирок (по 0.2 мл в каждую). Затем добавляли 0.8 мл поддерживающей среды. Учет результатов проводили ежедневно до 6-го дня по наличию цитопатогенного действия (ЦПД). Титры вируса вычисляли но статистическому методу Рида и Менча и выражали в инфекционных тканевых дозах (ИТД). Определяли 1-100 ИТД/0.2мл.
3. Противовирусный препарат.
Использована жидкая форма Зовиракса для внутривенных инъекций фирмы «Glахо Wеllсоmе» по 250 мг во флаконе.Исследования проводили согласно методическим указаниям "Методы испытания и оценки противовирусной активности химических соединений в отношении вируса гриппа", утвержденным Министерством здравоохранения СССР, 1977 г.
4. Определение токсичности препарата WN для клеточных культур.
При изучении токсичности препарата WN для культур клеток VегоЕ-б и Нeр-2 использовали ряд разведении препарата: цельнй. 1/2,1 /4. В пробирку с монослойными клеточными культурами вносили по 0.2 мл препарата в каждом разведении и 0.8 мл поддерживающей среды. На каждое разведение не менее 30 пробирок.
Контролем служили монослойные культуры клеток, в которые вносили по 1,0 мл поддерживающей среды.
Оценку токсичности проводили в течение 7 дней по наличию или отсутствию дегенерации клеточного слоя.
Токсичность соединения для клеточных культур оценивали согласно Методическим рекомендациям от 1977 г.
|
Процентдегенерации клеток |
Оценкатоксичности |
|
100-76 |
+++++ |
|
75-51 |
+++ |
|
50-26 |
++ |
|
25-6 |
+ |
|
6-0 |
0 |
5. Определение противовирусной активности препарата \VN на тканевых культурах VегаЕ-б и Нер-2.
Для изучения влияния на репродукцию вируса герпеса I типа (ВПГ 1) в культурах клеток Vего Е-6 и Нер-2 использовали препаратWN без разведения в соответствии с рекомендациями заказчика. В опыт взято по 3 группы пробирок (не менее 30 в каждой):
1) 1 ИТД вируса + 0,2 мл WN+ 0,8 мл поддерживающей среды;
2) 10 ИТД вируса + 0,2 мл WN+ 0,8 мл поддерживающей среды;
3) Контроль клеточной культуры + 1мл поддерживающей среды;
4) Контроль дозы вируса по 0,2 мл 1 и 10 ИТД + 0,8 поддерживающей среды.
6 Определение противовирусной активности зовиракса.
Использован Зовиракс для внутривенных инъекций.
Выбор доз Зовиракса и инфицирующей тканевой дозы вируса.
Испытания проведены с дозами ВПГ 1:1, 1; 10,1:100, 1:1000 ИТД.Концентрация Зовиракса в поддерживающей среде взятая в олыг составляла; 10 мг/мл; 5мг/мл; 2,5 мг/мл; 1 мг/мл; 0,5 мг/мл; 0,05 мг/мл и 0,025 мг/мл. Предварительно определена токсичность препарата Зовиракс для клеточных культур VегоЕ-б и Hер-2 и выбрана половина 1/2 минимальной токсической дозы (МТД). При выборе МТД контролем служили культуры клеток с поддерживающей средой.
При выборе дозы Зовиракса, не дающей полной защиты от вирусного инфицирования клеток, были взяты в опыт каждая доза вируса с каждой дозой Зовиракса. Контрольными группами служили: контроль клеточных культур с поддерживающей средой; контроль вируса и выбранный ИТД вируса без Зовиракса.
На основании полученных результатов, для дальнейших исследований и комплексного использования с препаратом WN были выбраны дозы Зовиракса 0,05 мг/мл и 0,025 мг/мл, не дававшие полной защиты клеточных культур. Во всех исследованиях в группу входило не менее 10 пробирок.
7. Комплексные исследования препарата WNс Зовираксом.
Из пробирок с монослойными клеточными культурами удаляли среду роста, затем в опытные пробирки вносили по 0.2 мл соответствующего разведения вируса, содержащего 1 или 10 ИТД, по 0.2 мл \VN и по 0.8 Зовиракса в поддерживающей среде в концентрации 0,05 мг/мл или 0,025 мг/мл.
Контрольными группами служили:
- Вирус в дозах 1 и 10 ИТД;
- препарат WN+ вирус в дозах 1 и 10 ИТД;
- препарат WN ;
‘ клеточная культура;
- Зовиракс + вирус;
- Зовиракс + культура клеток;
Был также проведен эксперимент с трехкратным введением препарата WNодновременно с вирусом , через 24 часа и 48 часов. В опыт были взяты 1 и 10 ИТД вируса и концентрация зовиракса 0,05 мг/мл и 0,025 мг/мл.
Оценку эффективности препаратов Z и WNпроводили путем определения 3показателей:
— определение титров вируса в кулыуральной жидкости опытной и контрольной групп (титрование вируса на тканевых культурах);
— учет ЦПД вируса в контрольной и опытных группах с последующим вычислением коэффициента и индекса защиты препарата WNи WNв комплексе с Z;
— определение индекса интенсивности репродукции вируса, который вычисляется путем отношения интенсивности размножения вируса в пробирках с ЦПД ко всем пробиркам, взятым в данную группу.
Коэффициент, индекс защиты и оценку эффективности препарата проводили согласно методическим указаниям «Методы испытания и оценки противовирусной активности химических соединений в отношении вируса гриппа», 1977 г. Для вычисления индекса защиты определяли коэффициент защиты тканевых культур:
% пробирок с вирусом в контроле
КЗ =—"——————————————————————————
% пробирок с вирусом в условиях введения препарата
Расчет индекса защиты проводили следующим образом:
КЗ- 1
ИЗ—————— х 100%
КЗ
Индекс интенсивности репродукции вируса рассчитывали используя «Методы первичного отбора и оценки противовирусной активности ингибиторов репродукции вирусов парагриппа III типа и РС инфекции» в НИИгриппа МЗ РФ от 1980 года.
Оценку активности препарата проводили по таблице:
|
Индексзащиты |
|
Оценкаактивности препарата |
|
0-29 |
- |
препаратне активен |
|
30-39 |
+ |
препаратобладает слабой активностью или результаты сомнительны |
|
40-59 |
++ |
препаратактивен |
|
60-79 |
+++ |
препаратактивен |
|
80 ивыше |
++++ |
препаратактивен |
II. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Изучение токсичности препарата WN для клеточных культур VегоЕ-6 и Нер-2.
Таблица I
Изучение токсичности препарата WN для клеточных культур
| Разведение препарата WN |
Количество пробирок в группе |
Наличие ЦПД |
% токсичности |
|||
|
|
VегоЕ-б |
Нер-2 |
VегоЕ-б |
Нер-2 |
|
|
|
Цельн. |
30 |
30 |
0 |
0 |
0 |
0 |
|
1/2 |
30 |
30 |
0 |
0 |
0 |
0 |
|
1/4 |
30 |
30 |
0 |
0 |
0 |
0 |
|
Контроль культуры клеток |
30 |
30 |
0 |
0 |
0 |
0 |
Данные таблицы 1 свидетельствуют, что препарат WN не токсичен для используемых в опыте тканевых культур.
Определение токсичности препарата зовиракс для клеточных культур.
Таблица 2,
Определение минимальной токсической дозы Зовиракса для тканевых культур VегоЕ-6 и Нер-2.___
|
Разведениепрепапрата |
VeroE-6 |
Hep-2 |
ЦПД |
Токсичностьпрепарата |
|
10мг/мл |
10 |
10 |
++++ +++ |
Препарат не токсичен |
|
5мг/мл |
10 |
10 |
- - |
Препарат не токсичен |
|
2,5мг/мл |
10 |
10 |
- — |
Препарат не токсичен |
|
1мг/мл |
10 |
10 |
- — |
Препарат не токсичен |
|
0,5мг/мл |
10 |
10 |
- — |
Препарат не токсичен |
|
0,05м г/мл |
10 |
10 |
- — |
Препарат не токсичен |
|
0,025мг/мл |
10 |
10 |
- — |
Препарат не токсичен |
|
Контрольклеток без Z |
10 |
10 |
- — |
Препарат не токсичен |
Результаты Таблицы 2 свидетельствуют, что минимальная токсическая доза Z. для клеточных культур в опыте — 10 мг/мл (МТД -10 мг/мл), Согласно методическим рекомендациям от 1977 года в опыт было взято 0,5 МТД 7. , что составило 5 мг/мл.
Определение игибирующего действия WN при инфицировании клеточных культур ВПГ I в дозах 1ИТД и 10 ИТД.
Таблица 3.
Определение ингибирующего действия WN при инфицировании клеточных культур ВПГ 1 в дозах 1 ИТД и 10 ИТД._
| Препарат\VN + МТД |
Кол-вопробирок в опыте |
Кол-вопробирок в без вируса |
КЗ |
ИЗ |
Индексинтенсивности репродукции вируса |
|
0,2мл WN +11ИТД ВПГ 1 |
30 |
24 |
5 |
80 |
0.2 |
|
0,2мл WN+10ИТД ВПГ 1 |
30 |
18 |
2.5 |
60 |
0.4 |
|
Культура клеток+1-10 ИТД ВШТ |
30 |
0 |
- |
- |
- |
|
Культураклеток |
30 |
30 |
- |
- |
- |
|
Культураклеток +WN |
30 |
30 |
- |
- |
- |
Из таблицы 3 следует, что препарат WN обладает высокой активностью в защите клеточных культур при инфицировании их различными дозами вируса.
Определение ингибирующего действия различных доз Z при инфицировании клеточных культур различными дозами вируса.
Таблица 4.
Ингибирующее действие противовирусного препарата Зовиракс на репродукцию ВПГ 1с различными инфицирующими дозами.
| Доза вируса | ||||
|
Концентрацияпрепарата |
ИТД1 |
ИТД10 |
ИТД100 |
%защиты |
|
Кол-во пробирок в опыте |
||||
|
5 мг/мл |
40 |
40 |
40 |
100 |
|
2,5 мг/мл |
40 |
40 |
40 |
100 |
|
1 мг/мл |
40 |
40 |
40 |
100 |
|
0,5 мг/мл |
40 |
40 |
40 |
100 |
|
0,05 мг/мл |
40 |
40 |
- |
75 (1 ИТД) 60(10ИТД) |
|
0,025 мг/мл |
40 |
40 |
- |
50 (1ИТД) |
|
Контроль вируса |
1ИТД +0,8 под.ср |
10ИТД+ 0,8мл под. ср |
|
|
|
Контроль культуры клеток |
|
|
|
|
|
Контроль Z 5 мг/мл |
|
|
|
|
|
контроль Z 2,5 мг/мл |
|
|
|
|
|
Контроль Z 0,025мг/мл |
|
|
|
|
Как видно из таблицы 4, Зовиракс в дозах от 5 мг/мл до 0,5 мг/мл давал полную защиту клеточного моносдоя от иифицирования всеми дозами вируса, взятыми в опыт. Зовиракс в концентрации 0,05 мг/мл и 0,025 мг/мл был взят в опыт лишь с 1 и 10 ИТД ВПГ1.
Таким образом, на основании полученных данных для дальнейшего исследования и комплексного использования с препаратом WN были отобраны дозы 0,05 мг/ мл и 0,025 мг/мл 2, поскольку они полностью не подавляют вирус.
Влияние препарата WN и WN + Zна репродукцию
ВПГ1 в тканевых культурах
Таблица 5
Ингибирующее действие препарата WN и WN + Z в различных концентрациях на репродукцию ВПГ1 с 1 и 10 ИТД.
|
Препарат+культура клеток |
Кол-вопробирок в опыте |
Кол-вопробирок в без вируса |
КЗ |
ИЗв% |
Индексинтенсивности репродукции вируса |
|
WN+ 1 ИТД вируса |
20 |
16 |
5 |
80 |
0.2 |
|
Z0,05 мг/мл + 1ИТД |
20 |
15 |
4 |
75 |
0.25 |
|
Z 0,025мг/мл + 1ИТД |
20 |
10 |
2 |
50 |
0.5 |
|
Z0,05 мг/мл + 1ИТД + WN |
20 |
20 |
Полнаязащита |
100 |
0 |
|
z0,025 мг/мл+1 ИТД + WN |
20 |
18 |
10 |
90 |
0.1 |
| WN+10 ИТД вируса |
20 |
12 |
2.5 |
60 |
0.4 |
|
Z0,05 мг/мл + 10ИТД |
20 |
12 |
2.5 |
60 |
0.4 |
|
Z0,025 мг/мл + 10ИТД |
20 |
9 |
1.8 |
45 |
0.1 |
|
Z0,05 мг/мл +10ИТД + WN |
20 |
20 |
Полнаязащита |
100 |
0 |
|
Z0,025 мг/мл +10ИТД WN |
20 |
18 |
10 |
90 |
0.1 |
|
Контролькультуры клеток |
20 |
- |
- |
- |
-2 |
|
Контрольвируса |
20 |
0 |
- |
- |
|
Данные таблицы 5 позволяют сделать вывод, что применение препарата WN в комплексе с малыми дозами противовирусного препарата Зовиракс может обеспечить 90 — 100 % защиту клеточного монослоя от инфицирования вирусом герпеса 1-го типа. Индекс интенсивности репродукции вируса был резко снижен до0 — 0,1 , по сравнению с контролем — 2,0.
Влияние препарата WN и WN в комплексе с Зовираксом при 3- кратном введении препарата WN/
Выявлено, что препарат WNкриомелт реализует свой защитный потенциал сразу после введения в культуру клеток . Последующее введение препарата WN повторно через 24 — 48 часов не оказывало усиливающего защитного действия от инфицирования клеток вирусом.
Таблица 6
Изучение противовирусной активности препарата WN, введенного на различных сроках в культуру клеток V его Е-6, инфицированных вирусом герпеса
|
ПрепаратWNи WN + Z |
Кол-вопробирок в опыте |
00часов |
24часа |
48часов |
||
|
. |
Вирус+WNодноврем |
WNчерез 24 час |
WNчерез 48 час |
ИЗв% |
ИЗв% |
ИЗв% |
|
WN+ 1 ИТД |
90 |
60 |
30 |
80 |
77 |
77 |
|
WN +Z0,05 мг/мл 1ИТД |
90 |
60 |
30 |
100 |
100 |
100 |
|
WN+0,025 мг/мл 1ИТД |
90 |
60 |
30 |
95 |
95 |
95 |
|
WN+10ИТД |
90 |
60 |
90 |
60 |
58 |
58 |
|
WN +Zо,о5 мг/мл 10ИТД |
90 |
60 |
30 |
100 |
100 |
100 |
|
WN+Z0.025 мг/мл10ИТД |
90 |
60 |
30 |
90 |
90 |
90 |
|
КонтрольКультуры клеток |
30 |
- |
- |
- |
- |
- |
|
Контрольвируса |
300,2мл 1и 10ИТД |
- |
- |
- |
- |
- |
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В результате проведенных испытаний выявлено:
1. Препарат WN не обладает токсичностью для культур клеток VегоЕ-6 и Нер-2
2. Препарат WN оказывал значительное ингибирующее действие на репродукцию вируса гернеса в тканевых культурах в первые часы после заражения (не менее 80% при 1 ИТД, при массивном заражении 60%), что предполагает возможность ею успешного использования в клинике.
3. Использование препарата WN в комплексе даже с малыми дозами противовирусного препарата зовиракс повышает индекс защиты клеток от инфицирования вирусом до 100 % .
Выявление данного факта очень важно в клинической медицине, т.к. дает возможность снизить дозу высокотоксичного препарата Зовиракса при комплексном использовании зовиракса и WN при герпетических инфекциях.
4. Экспериментально было также установлено, что введение препарата WN в пробирки с монослойными клеточными культурами способствовало стабилизации рН культуральной среды, а также улучшению жизнеспособности клеток, что, вероятно, связано с усилением мембранного потенциала клеток и их метаболизмом. Данный факт может играть важную роль при использовании его в культивировании клеток и вирусологических исследованиях.